Development of improved droplet microfluidic single-cell RT-PCR workflows. - Ilmenau. - 55 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2024
Das Ziel dieser Arbeit war es, einen verbesserten Arbeitsablauf für die RT-PCR in mikrofluidischen Tröpfchen zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf der Reduzierung der Hemmung durch hohe Konzentrationen von Zelltrümmern lag. Hierfür wurde die Methode der Hitze-Lyse validiert und eine neue Methode auf Basis der Droplet-spaltung eingeführt. Ein weiteres Ziel war es, einen Arbeitsablauf zu entwickeln, der mit Fixierung kompatibel ist, indem das Fixierungsprotokoll optimiert und Behandlungen nach der Fixierung eingeführt werden, um die Hemmung zu reduzieren. Mehrere Parameter, einschließlich der Lysemethode, der physikalischen Entfernung von Zelltrümmern und des Zellfixierungsprotokolls, wurden systematisch variiert, um die effektivste Kombination in Bulk-versuchen zu bestimmen. Nachdem die idealen Bedingungen ermittelt wurden, wurden sie auf einen Mikrofluidik-Workflow übertragen und die Droplet-spaltung als Methode zur physikalischen Entfernung von Zelltrümmern in Tröpfchen getestet. Es konnte bestätigt werden, dass die in der Literatur angegebene Konzentrationsschwelle von einer Zelle pro Nanoliter für den Beginn der Inhibition von RT-PCR durch Zelllysat zutrifft. Außerdem wurde bestätigt, dass die Inhibition durch Hitze-Lyse reduziert wird. Durch die Abtrennung von Zelltrümmern mittels Droplet-Spaltung konnte die Inhibition reduziert werden. Es wurde auch gezeigt, dass die Hemmung durch Zellfixierung minimiert werden kann. Eine RT-PCR-Amplifikation in Tröpfchen mit einer Größe von nur 50 Pikolitern wurde erreicht. Die Studie untersuchte den Effekt der Droplet-Spaltung auf die Hemmung mikrofluidischer Reaktionen durch Zelllysat. Außerdem wurden verschiedene Methoden zur Reduzierung der Reaktionshemmung durch Fixierung vorgestellt. Die Studie beschreibt eine Methode zur RT-PCR direkt aus Zellen in Pikoliter-Tropfen ohne weitere RNA-Aufreinigung.
Herstellung von Sensoren bestehend aus Schwefel- und Stickstoff-dotierten Kohlenstoffnanoröhren . - Ilmenau. - 53 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2024
In dieser Arbeit wird die Herstellung von Filmen Schwefel- und Stickstoff- dotierter Kohlenstoffnanoröhren (S-/N-MWCNTs) als mögliches Elektrodenmaterial für elektrochemische Biosensoren beschrieben. Es wurde ein Verfahren der chemischen Gasphasenabscheidung mit Acetonitril (ACN) und Dimethylsulfoxid (DMSO) als Ausgangsstoffen sowie Ferrocen als Katalysator angewandt. Anschließend wurden S-/N-MWCNTs mit unterschiedlichen DMSO-Anteilen morphologisch und hinsichtlich ihrer elektrokatalytischen Eigenschaften untersucht. Erster untersuchter Analyt war das Redoxsystem Hexacyanoferrat (II/III). Hierbei konnten die guten, jedoch nicht herausragenden elektrochemischen Eigenschaften der S-/N-MWCNTs gezeigt werden. Bei der Untersuchung der Biomoleküle Glucose, Ascorbinsäure, Dopamin und Harnsäure konnte keine Reaktion der Glucose an den S-/N-MWCNTs festgestellt werden. Die Analyse von Ascorbinsäure war nicht zufriedenstellend. Dopamin und Harnsäure reagieren jedoch empfindlich auf S-/N-MWCNTs, sodass sie mit niedrigen Nachweisgrenzen gut analysierbar sind.
Selektive 1,4-Hydrierung als Kernschritt in der Synthese von cis-3-Hexenol unter industrierelevanten wirtschaftlichen Rahmenbedingungen. - Ilmenau. - 39 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2024
Diese Bachelorarbeit ist in der Forschungs- und Entwicklungsabteilung der Miltitz Aromatics GmbH Bitterfeld-Wolfen entstanden. Im Rahmen dieser Bachelorarbeit wurde die stereoselektive Hydrierung eines Diens untersucht. Dazu wurden im ersten Teil der Arbeit zwei kommerziell erhältliche Katalysatoren für die Reaktion getestet. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Abtrennung und Regeneration des bereits für die Reaktion etablierten Katalysators. Dazu wurden zweiphasige Systeme untersucht. Es wurde eine Versuchsreihe mit unterschiedlichen polaren Lösungsmitteln durchgeführt. Der letzte Teil der Arbeit betrachtet eine Metathesereaktion. Der Ausgangsstoff für die Metathesereaktion wurde durch zwei Synthesestufen nach in der Literatur beschriebenen Methoden erhalten. Der für die Reaktion einzusetzende Katalysator wurde in Kooperation mit der Technischen Universität Ilmenau aktiviert. Die Aktivität des Katalysators wurde anhand einer Testreaktion überprüft und konnte bestätigt werden. Da diese Arbeit in einem industriellen Rahmen entstanden ist, wurden alle Versuche unter den Aspekten Wirtschaftlichkeit und Skalierbarkeit geplant.
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2024
Die elektrochemische Analyse von Paracetamol erfolgt zyklisch Voltammetrie. Das Experiment verwendet drei verschiedene Elektroden mit einer Scanrate von 20 mV/s verwendet, was bis zu 3 Zyklen in einer Messung entspricht. Als Lösungsmittellösung wird phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) verwendet, und als Stammlösung werden zwei unterschiedliche Konzentrationen (0,2 M für Platin und 0,02 M für Glaskohlenstoff und mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren) Paracetamol verwendet. Der Versuch wird in 10 verschiedenen Konzentrationen durchgeführt jede Messung jeder Arbeitselektrode. Zyklische Voltammetrie-Diagramm, Epa (anodisches Spitzenpotential) und Ipa (anodischer Spitzenstrom), Epc (kathodisches Spitzenpotential) und Ipc (kathodischer Spitzenstrom), Bestimmtheitsmaß (R2) zwischen Konzentration und Spitzenströmen, Nachweisgrenze (LOM) , Elektronentransfer Geschwindigkeitskonstante (k0) und aktive Oberfläche (A) sind die Parameter, die in diesem Experiment beobachtet werden müssen. Aus den Beobachtungsergebnissen geht hervor, dass die Arbeitselektrode aus mehrwandigen Kohlenstoffnanoröhren die beste Detektion von Paracetamol durchführt, gefolgt von Glaskohlenstoff und Platin. Diese Schlussfolgerung lässt sich aus den Ergebnissen des Bestimmtheitsmaßes (R2) sowie der Nachweisgrenze (LOM) ableiten. Auch die aktive Oberfläche trägt zur Erklärung der besten Leistung der mehrwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen-Arbeitselektrode bei. Aus der berechneten Elektronentransfer Geschwindigkeitskonstante geht hervor, dass die Scan Rate die Ergebnisse nicht beeinflusst, sondern durch mehrere vermutete Faktoren verursacht wird.
Untersuchung der Rhodium-katalysierten Carbonylierung von Toluol mit verschiedenen Kohlenmonoxiddonoren unter Verwendung der Kernmagnetresonanzspektroskopie. - Ilmenau. - 59 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2024
Untersuchung der Kinetik der lichtgetriebenen CO-Abspaltung verschiedener Kohlenmonoxiddonoren und der anschließenden Carbonylierung von Toluol mit dem Präkatalysator [RhCl(CO)(PMe3)2] mittels NMR-Spektroskopie. Die Arbeit konzentriert sich auf den Zusammenhang zwischen den unterschiedlichen Strukturen der Kohlenmonoxiddonoren und der Reaktionsgeschwindigkeit. Weiterhin wird der Einfluss der Lichtintensität und der auftretenden intermediären Katalysatorspezies untersucht.
Rhodium katalysierte Carbonylierung von CH-Bindungen. - Ilmenau. - 32 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2023
In dieser Bachelorarbeit geht es um die Funktionalisierung von linearen und aromatischen Kohlenwasserstoffen. Diese sollen hierbei mithilfe von Kohlenstoffmonoxid, Rhodium-Phosphan-Katalysatoren und UV-Bestrahlung in die jeweiligen Aldehyde umgewandelt werden. Dabei liegt das Augenmerk auf der Optimierung der Synthesebedingungen, wie zum Beispiel der Wahl des Katalysators, der Einstellung der Lichtintensität oder der Verwendung verschiedener Kohlenwasserstoffe. Bei den während der Forschung verwendeten Kohlenwasserstoffen handelt es sich um Benzol und Hexan, welche zu Benzaldehyd und Heptanal funktionalisiert werden sollten.
Erzeugung membrangängiger Liposomen zum Einbringen von DNA in eukaryotischen Zellen. - Ilmenau. - 65 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2023
In dem ersten Teil dieser Masterarbeit wurde eine Methode für die Herstellung von Liposomen, die aus Cholesterol, PEG-2000 und DSPC bestehen, entwickelt. Um die Methode zu etablieren und die beste Partikelgrößenverteilung mit der kleinsten Standardabweichung und der größten Anzahl an Liposomen zu erzeugen, wurden verschiedene Parameter wie zum Beispiel Mischungsart, -zeit, und -temperatur optimiert. Die besten Ergebnisse wurden mit Ultraschall mit einer Mischungsart von 120 min bei einer Temperatur zwischen 60 und 70 ˚C erzielt. Die Methode produziert reproduzierbare LNPs mit einem mittleren Radius von 2,2 μm und einer Standardabweichung von 0,1 μm. Die Charakterisierung der Lösungen wurde mittels Lichtmikroskopie und einer statistischen Auswertung der erhaltenen Bilder mithilfe der Software FIJI durchgeführt. Die optimierte Methode wurde verwendet, um T7-DNA als Testsystem für ein therapeutisches Mittel einzukapseln. Dafür wurde Lipofectamine 3000® als katonisches Lipid verwendet, das die Verkapselung der T7-DNA fördert. Um die Verkapselungsfähigkeit auswerten zu können, wurde eine Färbung des T7-Genoms mit PI durchgeführt und durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Verkapselung wurde mit der Beobachtung von fluoreszierenden Liposomclustern überprüft, wobei die kugelförmigen LNPs unterscheidbar sind. Zur Reinigung dieser Liposomenlösung wurde eine Methode entwickelt, die auf Zentrifugation und Redispergierung in TE-Puffer basiert. Eine optimale Reinigung der Lösung wurde mit einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 4000 RPM (1789 G-Force) für 5 Minuten bei 4 ˚C und 6 edispergierungsschritten in Puffer erreicht, ohne die Stabilität oder morphologischen Eigenschaften der Liposomen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde als Ergebnis dieses Prozesses eine homogene Lösung erhalten. Auf der anderen Seite wurde die Schutzfähigkeit der LNPs in Bezug auf die T7-DNA anhand der Verwendung einer Endonuklease (DNase I) bewertet. Die Stabilität der Liposomen wurde durch Fluoreszenzbilder und Lichtmikroskopie untersucht, die Ergebnisse zeigen, dass die Liposomen die Fähigkeit haben, das T7-Gemon vor dem Nukleaseverdau zu schützen. Zum Schluss wurde die Infektionsfähigkeit der Liposomen mit eingekapselter T7-DNA durch einen in vitro Test an einer Zellkultur der Linie HEP-G2 ausgewertet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Vergleich einer Negativkontrolle mit einer Dreifachprobe sowohl durch Fluoreszenzmikroskopie mit Färbung als auch anhand des Cell Counter CASY®untersucht. Liposomen bewirken eine Verringerung des Anteils der lebensfähigen Zellen um 24,7 %, was durch Fluoreszenzmikroskopiebilder bestätigt wurde. Aus den in dieser Masterarbeit gewonnenen Erkenntnissen kann im Wesentlichen geschlossen werden, dass die entwickelte Methode die Herstellung stabiler Liposomen mit der Fähigkeit, DNA aus dem T7-Bakteriophagen einzukapseln, zu schützen und in eine eukaryotischen Zelle der Hep-G2-Zelllinie zu transportieren und zu infizieren, gelungen ist.
Zur Synthese von neuartigen Biphenylen und Buchwald-Phosphanen. - Ilmenau. - 35 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2023
Das Ziel dieser Bachelorarbeit war die Synthese von neuen BrettPhos-artigen Buchwald-Phosphanen (Dialkylbiarylphosphane). Die Synthese der Biphenyle erfolgte mittels einer Kupplungsreaktion von zwei Benzolderivaten durch die Reaktion eines Grignard-Reagenzes mit einem Arin, welches in situ hergestellt wurde. Anschließend wurden die Biphenyle mit einem Chlordialkylphosphin zu einem Buchwald-Phosphan umgesetzt.
Modellierung von in vivo Mikrotopografien durch folienbasierte Formenstrategien und Kokultivierung von Zellen. - Ilmenau. - 78 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2023
Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, eine Methode zu entwickeln, die ein gezieltes Zellwachstum auf beiden Seiten eines mikrostrukturierten 3D-Zellgerüsts ermöglicht. Eine Seite wurde durch das Microcontactprinting strukturiert, während die Strukturierung der anderen Seite nach Auftrag des Zellrasens erfolgte. Die neue Methode des Wipings ermöglicht das gezielte Entfernen von Zellen auf höhergelegenen Bereichen eines Scaffolds. Sie wurde an Lines and Spaces-Strukturen, die aus einer porösen Polycarbonatfolie hergestellt und mit einer Kokultur aus EA.hy926- und HepG2-Zellen besiedelt wurden, ausgearbeitet. Es wurde das Wiping sowohl in der Mono- als auch in der Kokultur untersucht und etabliert. Mehrere fragliche Parameter, die das Ergebnis des Wipings beeinflussen, wurden optimiert. Zudem wurde neben der Schaffung der notwendigen fluidischen Randbedingungen ein einfaches Protokoll ausgearbeitet, dass reproduzierbare Ergebnisse in guter Qualität ermöglicht Als Nachweis eines erfolgreichen Wipings wurden Untersuchungen unter dem Lichtmikroskop, dem Rasterelektronenmikroskop und dem Laserscanningmikroskop vorgenommen sowie Life-Dead-, Immunfluoreszenz-, DAPI- und Aktinzytoskelett-Färbungen vorgenommen. Mit Ausblick auf weitere Untersuchungen wurde zudem probeweise eine wabenförmige Struktur ausgetestet.
Charakterisierung der Keanumycinbildung im Labormaßstab. - Ilmenau. - 53 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2023
Pflanzenschutzmittel sind in der heutigen Zeit unumgänglich. Hierbei wird täglich nach neuen Mitteln gesucht, um Pathogene effektiv bekämpfen zu können ohne die Pflanzen zu schädigen. Dabei zeigten sich besonders die cyclischen Lipopeptide als vielversprechend. Ein Vertreter dieser Klasse ist das Keanumycin A, welches vom Bakterium Pseudomonas fluorescens produziert wird. Das Keanumycin A zeigt eine sehr starke antimykotische Wirkung. Somit eignet es sich gut für die landwirtschaftliche Anwendung. In dieser Bachelorarbeit wurde die Keanumycinproduktion unter Variation des Mediums, sowie der Verfahrenstechnik untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass eine Erhöhung der Kohlenstoffquelle sich positiv auf die Keanumycinproduktion ausübt. Bei erhöhter Kohlenstoffquelle im Batch-Ansatz konnte eine Steigerung von 254 % (3,23 mg/l) erreicht werden. Bei Verwendung eines Fed-Batch-Prozesses wurde eine Maximalkonzentration von 5,32 mg/l (419 %) erreicht. Schlagwörter: Antimykotisch, Cyclische Lipopeptide, Pseudomonas fluorescens, Keanumycin, Pflanzenschutzmittel