Studienabschlussarbeiten am Institut

Bei COVID-19 handelt es sich bisher meistens um eine relativ milde Erkrankung. Sie ist aber hochansteckend und kann bei ungünstiger Veranlagung (Genetische Faktoren, Alter, Gesundheitszustand) einen schweren bis tödlichen Verlauf haben [3]. Der bisherige Pandemieverlauf lässt sich anhand der Red Queen Hypothese und der Muller’s ratchet Theorie erklären und die Versuchsergebnisse der Arbeiten mit Phagen unterstützen dies. Die steigende Virulenz zu Beginn der Pandemie als gar keine oder wenige Leute geimpft waren, konnte durch die Entwicklung der Phagen bei der large Scale Passage repräsentiert werden. Die verringerte Virulenz in den jetzigen Mutanten kann ein Einfluss des Impfstoffes sein und wird durch den Effekt der Plaque to Plaque Experimente repräsentiert. Jedoch ist der weitere Verlauf der SARS-CoV-2 Pandemie nicht vorhersehbar. Im Rahmen der Phagenexperimente konnte beobachtet werden, dass es plötzlich zu einem unerwarteten Anstieg oder Abfall der Fitness kommen kann. Im Rahmen dieser Masterarbeit sollte herausgefunden werden, ob die RQH und Muller’s ratchet Theorie auf T4 Bakteriophagen anwendbar sind. Dazu sollte geprüft werden, ob sich die Theorien auf DNA-Viren genauso auswirken, wie auf RNA-Viren. Untersucht werden sollte die Entwicklung der Fitness, die Veränderungen der Phagenkonzentration sowie der Verlauf der Wurfgröße von T4. Die Untersuchung der Parameter erfolgt unter Anwendung die Methode des Large Scale Passage (RQH) und Plaque to Plaque Assay (Muller’s ratchet). Zusätzlich sollte im Fall von large Scale Passagen die Burstzeit untersucht werden, während beim Plaque to Plaque der durchschnittliche Plaquedurchmesser und die dazugehörige Wachstumsrate untersucht werden. Weiterhin sollten genotypische Veränderungen von T4 Bakteriophage im Laufe der Passagen anhand Gelelektrophorese analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Theorien nicht nur auf DNA-Phagen anwendbar sind, sondern dass sie einen ähnlichen Verlauf wie RNA-Viren aufweisen. Außerdem ist es wichtig zu erwähnen, dass der Korrektur Mechanismus der DNA-Phagen, sowie die Größe der Phagen, einen merklichen Einfluss auf die Untersuchungsergebnisse hat. Im Vergleich zu RNA Viren sind die theoretisch vorhergesagten Effekte bei den untersuchten DNA-Phagen nicht so stark ausgeprägt, aber immer noch sichtbar. Weiterhin konnte durch die Untersuchung einzelner Plaques gezeigt werden, dass es innerhalb einer Population diverse Unterschiede der Wachstumsraten gibt und die damit einhergehenden Plaquegrößen sehr verschieden sind. Im Fall von large Scale Passagen wurde eine vergleichbare Tendenz bzw. ein Fitnessanstieg wie bei den RNA Viren festgestellt und die Anwendbarkeit der Theorie bestätigt. Für einen genaueren Vergleich müsste die Anzahl der Versuche noch deutlich erhöht werden. Die Analyse durch die Gelelektrophorese, um die aufgetretenen Mutationen zu beobachten, was eine Bestätigung der Ergebnisse geben könnte, war wegen der ghmc in T4 DNA nicht möglich. Hier könnte die Verwendung einer klonierten T4 DNA das Problem lösen. Dieser Schritt wäre jedoch sehr zeitaufwendig und es besteht die Möglichkeit, dass die ghmc Struktur von T4 einen Einfluss auf die Fitness hat.

Der Verlauf der viralen Fitness von Phagen bei large Scale Passagen wurde schon in den 90er Jahren mit humanpathogen RNA-Viren untersucht. Aufgrund der hohen Pathogenität von verschiedenen Viren, die in den letzten Jahren Bekanntheit erlangten, wurden im Rahmen dieser Arbeit Experimente über der viralen Fitness bei large Scale Passagen mit harmlosen DNA-Viren wie Bakteriophagen T7 durchgeführt. Die Experimente zeigen, dass die Untersuchung der viralen Fitness von T7 bei large Scale Passagen teilweise zu einer Fitnesserhöhung führt. Es folgt dann eine Abnahme der Burstzeit, eine Zunahme der Wurfgrößenrate sowie eine Minderung des Phagentiters im Laufe der Passagen. Zusätzlich zeigt die DNA-Analyse unterschiedliche Mutationen des Genoms im Laufe der Passagen.

Diese Arbeit befasst sich sowohl mit der Synthese neuartiger Thiazolkörper, als auch mit der Untersuchung einiger Molekülstrukturen hinsichtlich potentieller Sensoreigenschaften. Dabei wird zum einen in 2-Position Pyren und zum anderen eine Verbrückung zu einem 2,2'-bis-Thiazolsystem realisiert. Zusätzlich wird die oft mit Carbonsäure funktionalisierte Position 5 und die Hydroxy-Position 4 dabei in zusätzlicher Derivatisierung herangezogen. Die intensive Fluoreszenz vieler 4-Hydroxy-1,3-thiazole und ihrer Derivate kann eine Applikation als fluoreszente Chemosensoren in einem biologischen Umfeld ermöglichen. Die Anwendung als fluoreszente Chemosensoren konnte bei Pyrenthiazolen für Kohlenstoffdioxid und Sauerstoff sowie pH-Wert und Polarität aufgezeigt werden. Die verbrückten 2,2'-bis-Thiazolsysteme demonstrierten eine ausgezeichnete Respons auf Magnesium, welches ein breites Anwendungs- und Forschungspotential besitzt. In zusätzlichen Untersuchungen war es möglich, durch Substitution ein Chlorid in 4-Position eines Thiazols einzuführen. Ebenfalls soll eine Acetylgruppe in 5-Position eingeführt werden, was allerdings in dieser Arbeit nicht vervollständigt wird.

Die Möglichkeit, Organoide aus Stammzellen zu erzeugen, eröffnet ganz neue Möglichkeiten für Bereiche wie der Wirkstoffforschung, hin zu Anwendungen in der personalisierten Medizin. Besonders das Gehirn und zentrale Nervensystem ist auch heute noch für die Forschung nur schwer zugänglich. So konnten beispielsweise bereits cerebrale Organoide aus hESC erzeugt werden, an denen sich die Entwicklung des menschlichen Gehirnes beobachten lässt. Der Anwendung von Organoiden im großen Stil steht im Weg, dass die Herstellung zum einen relativ aufwändig ist und zum anderen die hergestellten Organoide untereinander wenig homogen sind. Durch die Verwendung der an der TU Ilmenau entwickelten MatriGrids® wurde versucht, den Herstellungsprozess von cerebralen Organoiden nach dem Protokoll von Lancaster et al. Im Bezug auf die Ausbeute und die Homogenität zwischen den Organoiden zu verbessern. Hierzu wurden neuartige MatriGrids® verwendet, bei denen PLGA-Fasern in die Kavitäten eingespült wurden. Die Verwendung der PLGA-Fasern soll die Ausbildung von Neuroektoderm positiv beeinflussen.

Organ-on-a-Chip (OoaC) Mikrosysteme sind neuartige Testinstrumente mit perfundierten 3D-strukturierten Zellkulturen, welche die Physiologie von Organen nachbilden. Genaue Kontrolle der mikrophysiologischen Bedingungen und Verwendung von mehreren Zelltypen sind wesentlicher Fortschritte im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Zellkulturen. Der Einsatz von OoaCs verspricht eine Optimierung/Beschleunigung der Wirkstoffentwicklung, die Ermöglichung personalisierter Medizin und eine Verminderung des Bedarfs an Tierversuchen. Zwei OoaC-relevanten Modulen wurden konstruiert: (a) Ein modularer Luftblasen-Entferner; (b) eine programmierbare Mehrkanalpumpe für die Zugabe von Nährstoffen, Hormonen und sonstigen bioaktiven Substanzen. (a) Luftblasen in OoaCs sind zytotoxisch und behindern die Perfusion. Sie werden entweder infundiert oder entstehen aus Lufteinschlüssen während Temperatur- oder Druckschwankungen. Ein mikrofluidischer Blasenentferner wurde gebaut, dessen mikroporöse Membran (Porendurchmesser: 0,3 [my]m) die Luftblasen zu einer 1 mm dicken PDMS-Membran lenkt die sie in eine Vakuumkammer führt. Normaler Perfusion (0-150 [my]l/St.) ergab eine effektive Blasenentfernung (Halbwertszeit: 12 Min.). Weiter zeigten sich kaum Effekte der Betriebsparameter (Perfusionsrate und fluidischer Widerstand) auf die Blasenentfernung. COMSOL-Modelle der Blasenentfernung entsprachen den experimentellen Beobachtungen. Eine dünnere, semiporöse PDMS-Membran beschleunigte die Blasenentfernung um das Doppelte. Simulationen zeigten, dass die 1 mm dicke PDMS-Membran, die -900 mbar ausgesetzt wird, den Luftgehalt des Mediums um 36 % vermindert, was stromabwärts Luftblasen reduzieren könnte. Zum Schluss wurde ein Konzept des "non-porösen Schwamms" präsentiert, zur Luftblasenentfernung mit PDMS ohne externe Vakuumleitungen. (b) Eine programmierbare Mehrkanalpumpe wurde entworfen, um physiologiegerechte Abgabe von komplexen Medien an OoaCs zu realisieren. Schrittmotoren, kontrolliert von einem Arduino-Mega-2500 Mikrokontroller, betätigen Spritzen mit den jeweiligen Medienkomponenten. Zur Eingabe von Infusionsmustern wurde eine Excel-ähnliche Benutzerfläche erstellt. Eine Windows GUI Konsole wurde in Visual Basic 2017 und Python 3.7 programmiert zur Konversion der Infusionszeitpläne in ausführbare Pumpdateien. Ein Arduino Sketch (in Arduino C) diente zur elektronischen Ansteuerung der Schrittmotoren.